GSEA原理和使用方法浅析

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在RNA-seq数据的分析流程中，基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）是一种很常用的下游分析方法。这一方法在2005年由MIT博德研究所开发，用于确定先验定义的基因集（如特定信号通路的编码基因、疾病性状的关联基因等）是否在基因表达差异分析的结果上出现统计学显著性。

因为课题的原因，最近再一次复习了一下GSEA方法。目前有许多工具都能进行GSEA分析，例如博德研究所官方提供了一个基于Java编程语言开发的GSEA计算工具 ，南方医科大学的余光创教授开发的R语言工具包ClusterProfiler也提供了GSEA分析的功能。本文将简单介绍一下GSEA的原理，并举例说明如何使用博德研究所官方的工具包做GSEA分析。

一、原理

正如前文所述，GSEA想看的是一系列基因集在差异分析结果中的显著性。以下图为例，其来自于Cell期刊上一篇研究疾病模型的文章（ Disease Model of GATA4 Mutation Reveals Transcription Factor Cooperativity in Human Cardiogenesis）。在这幅图中，作者想要研究GATA基因的突变对心脏功能的影响，作者首先在GATA基因野生型（iwt）和突变型（G296S）两组样本之间进行了差异表达分析，找到了一系列差异基因，随后用不同的基因集做GSEA，发现Cardiac Development（心脏发育）基因集在野生型中普遍表达偏高，而Endothelial/endocardial（内皮或内膜发育）基因集在突变型中表达偏高，因此推测GATA基因的G296S突变可能通过心脏内皮或内膜的过度发育导致心脏相关疾病的产生。

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我们可以观察一下这幅图。在每个小图中，都可以分为上下两个部分，上半部分是一条绿色的曲线，其与y=0轴围成的曲线的面积代表GSEA的富集分数，这个分数的正负号代表基因集富集的方向，而绝对值反映了基因集在我们的差异基因列表中是否显著富集。下半部分是一系列黑线，黑线的位置代表了基因集在我们的差异基因列表中的位置。GSEA的原理就是看一个特定基因集（如果不懂什么叫基因集，可以简单理解为一个GO term或KEGG pathway）在我们实验得到的gene rank list中富集到的位置。一般来说，gene rank list会按照差异表达进行排序，越靠前说明表达差异越大；而一个基因集如果富集到gene rank list中更加靠前的位置，则说明这个基因集在我们的实验中更重要。

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更直观的原理可以参考上面这张图。首先，给定一个按基因表达差异排序的基因表 $L$ 和一个预先定义的基因集 $S$ ，GSEA的目的是判断 $S$ 里面的成员 $s$ 在 $L$ 里面是随机分布还是聚集在 $L$ 的某一侧（顶部或底部）。若研究的基因集 $S$ 的成员显著聚集在 $L$ 的顶部或底部，则说明此基因集成员对表型的差异有贡献，也是我们关注的基因集。主要步骤包括下面三步：

  • step1：富集分数（ES）的计算。ES反映了一个 $S$ 在整个 $L$ 的某一侧（顶部或底部）过度表达的程度。计算得分的方法是沿着 $L$ 向下走，每走一步时，如果遇到 $S$ 中的一个基因，则running-sum 统计量增加，否则running-sum 统计量减少，增加或减少的幅度取决于基因的权重。最终的running-sum 会形成一条曲线，如本文第一张图中的绿色曲线和上图中右下角的红色曲线。
  • step2：估计ES的显著性。这里使用了置换检验的方法进行统计检验。
  • step3：对显著性p值的矫正。通常我们在做GSEA时一次会测试若干个基因集 $S$ 在 $L$ 中的富集情况，因此需要使用FDR等方法矫正p值。

一次GSEA会检测几百甚至几万个基因集。这些基因集可以由研究者自行定义，也可也直接使用MSigDB数据库预先定义的基因集。在MSigDB数据库中，这些基因集被归类为H、C1、C2等多个大类，研究者可以一次选择所有的基因集做GSEA，也可只挑选其中一部分感兴趣的基因集。一般来说，选择C1基因集则是看基因的染色体区域分布，C5基因集则是GO term的富集分析。

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关于GSEA和MSigDB的更多内容，还可以参考官方文档

二、安装

GSEA的安装包可以从官方网站的下载界面 https://www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads.jsp 中下载。首次打开这个页面需要注册（如下图），注册步骤很简单，不需要等待太久。

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注册完成后登录，就可以看到安装包的下载链接了。如下图，GSEA提供了多个不同平台的安装包版本，其中前三个自带了java11的运行环境，一键安装即可，而最后一个跨平台的命令行版本需要使用系统自带的java。如果怕麻烦，直接下载前三个安装包就好了。

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除了GSEA软件本体，我们还需要下载预定义的基因集。MSigDB提供了基因集的下载链接，见 https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/human/collections.jsp 。如下图，这里提供了好几种格式的基因集压缩包，其中包括gene symbol版的gmt文件、NCBI Enterz版的gmt文件，以及sqlite数据库格式和json格式。做GSEA的话我们只需要前面两种，具体使用gene symbol版还是NCBI Enterz版要看具体情况。

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三、数据格式

GSEA需要的文件格式包括下面这几类。

Data File Content Format Source
Expression dataset Contains features (genes or probes), samples, and an expression value for each feature in each sample. Expression data can come from any source (Affymetrix, Stanford cDNA, and so on). res, gct, pcl, or txt 差异表达矩阵文件
Phenotype labels Contains phenotype labels and associates each sample with a phenotype. cls 自行提供，需要与表达矩阵中的样本一一对应起来
Gene sets Contains one or more gene sets. For each gene set, gives the gene set name and list of features (genes or probes) in that gene set. gmx, gmt or grp 预定义的基因集文件。MSigDB中提供了这一类文件的下载，也可也根据官方文档自行定义
Chip annotations Lists each identifier on a platform and its matching HGNC gene symbol. Optional for the gene set enrichment analysis. chip 芯片探针数据的转换文件。可选。
Ranked List File Format It is used when you have a pre-ordered ranked list that you want to analyze with GSEA. rnk 如果使用GSEAPreranked模式，则需要提供这个文件

各种文件格式的定义方式都可在官方文档中查看

四、在Linux命令行中使用GSEAPreranked模式进行GSEA分析

因为我的实验数据并非基因差异分析数据，无法提供差异表达矩阵，只能使用GSEAPreranked模式跑分析。首先我们要准备一下.rnk文件（文件名为data.rnk），部分内容如下：

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EXD1    -0.5544303794287568
ADAMTS20        -0.23010931295285122
GM11983 -0.15299636226669294
FADS6   -0.12841138655571432
E230025N22RIK   -0.07365590184865184
...
GP6     0.03374213133309236
PIWIL4  0.03461178330715221
MAK     0.0352834952139725
SH2D1A  0.05047290095967518
CPA6    0.05602483790084039

.rnk文件是一种制表符分隔的文本文件，第一列是基因名称，第二列是基因的权重。在这个文件里面，基因排序与否并无所谓，因为GSEA会根据基因权重再做一次排序。

我们还需要一份预定义的基因集文件msigdb.v2023.1.Hs.symbols.gmt。这个文件从MSigDB网站直接下载即可。

使用下面这份bash脚本，即可完成对我们的结果的GSEA检验。其中调用的是gsea-cli.sh这个脚本，部分传入参数的含义在下面进行了解释。

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#!/usr/bin/bash
gsea-cli.sh GSEAPreranked \ #使用GSEAPreranked模式
        -gmx msigdb.v2023.1.Hs.symbols.gmt \  #预定义基因集的文件路径
        -collapse No_Collapse \ 
        -mode Abs_max_of_probes \
        -norm meandiv \ 
        -nperm 1000 \ # 置换检验的随机模拟次数
        -rnd_seed timestamp \  # 置换检验的随机种子
        -rnk data.rnk \  # RNK文件的路径
        -scoring_scheme weighted \
        -rpt_label GSEA_test \ # 报告文档的标题
        -create_svgs false \
        -include_only_symbols true \
        -make_sets true \
        -plot_top_x 20 \ 
        -set_max 500 \  
        -set_min 15 \ 
        -zip_report true \ #是否使用zip打包压缩报告文档
        -out result  # 报告文档的输出文件夹

每一次运行会建立一个文件夹，并在文件夹内生成大量结果文件（html+csv+png），其中index.html是概括性的文件，部分信息如下。

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可以看出这里列出了使用到的geneset的数量和富集显著的geneset的数量；除此之外，点击链接可以看到更详细的显著富集的geneset的名称和p-value，以及图片报告，如下：

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蓝色竖线代表geneset在gene rank list中出现的位置，如果蓝色竖线越在左侧集中，则说明这个geneset富集程度越高。

五、其他补充 & 参考文献

当然，博得研究所开发的这款GSEA软件，也支持图形界面下的操作，甚至可以和cytoscape联动绘制不同基因集之间的相互作用。这一部分的内容我没有做太多深究，想要进一步了解的朋友可以参考 《一文掌握GSEA通路富集分析，超详细教程！》 - 生信宝典 陈同的文章 - 知乎 。本文其他参考文献如下：

其他链接：