《自然》论文：多个重叠的结合位点决定转录因子占据情况

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这周组会上讲述的一篇论文。作者提出了一种检测蛋白质和DNA之间低亲和力相互作用的技术PADIT-seq，并通过这种技术发现了转录因子调控中的两种新机制。

Citation：Khetan, S., Carroll, B.S. & Bulyk, M.L. Multiple overlapping binding sites determine transcription factor occupancy. Nature (2025). doi:10.1038/s41586-025-09472-3

本文另见微信公众号报道：
Nature | DNA的“俄罗斯套娃”：PADIT-seq揭示了一个颠覆教科书的转录因子结合新模型

背景

（一）作者信息：

本文的作者团队均来自哈佛大学医学院（更详细的信息可见 课题组官网 ）。研究团队聚焦于转录因子结合的生物学机制研究，开发了大量技术和软件工具，自2002年起，已发表近百篇论文和十多种软件工具。

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（二）前人研究：检测蛋白质-DNA互作的技术

文章中提到了如下技术：

  • PBM：一种基于微阵列的检测技术，可以大规模检测一种蛋白质和不同DNA的互作。 优点 ：高通量；成本低（并且为本文实验室首创，有大量技术积累）。 缺点 ：只能检测高亲和力的DNA片段，对于低亲和力片段的敏感性不足。
    • uPBM：是PBM的变种方法。PBM的微阵列上附着的是天然存在的DNA片段，但是uPBM上附着的是经过数学计算的所有可能的DNA序列组合。 因此理论上uPBM可以检测一种特定转录因子的所有潜在DNA结合片段。
  • HT-SELEX：基于多轮扩增反应，对高亲和力DNA片段进行富集。优缺点和PBM相同。
  • MITOMI：一种基于微流控系统的检测技术。优点 ：可以精确定量蛋白质和DNA之间的作用力强度（以化学平衡常数 $K_d$ 计）。 缺点 ：测序通量较低，并且无法用于发现未知的高亲和力片段。
  • BET-seq：一种基于微流控系统的高通量检测技术，相比于MITOMI改进了控制系统和测序方法，并在下游分析技术中引入了深度学习模型。优点 ：可以精确定量蛋白质和DNA之间的作用力强度（以相对自由能变化 $\text{ΔΔ}G$ 计），测序通量较高，可用于发现未知的高亲和力片段。 缺点 ：成本较高。

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本文的出发点在于，如何寻找那些与转录因子有较低亲和力的DNA片段（作者认为这些低亲和力片段也有重要的调控功能），同时降低实验成本。最终，作者提出了PADIT-seq，在体外系统中通过两阶段的转录，实现低亲和力片段的发现。

本文研究结果

（一）提出了一种新方法：PADIT-seq

PADIT-seq = protein affinity to DNA by in vitro transcription and RNA sequencing

这是一种 体外 的TF结合位点筛选方法。（注意和ChIP-seq之类的方法的区别——后者是体内方法）。

虽然先前已经有许多种TF-DNA binding检测方法，但作者提出的新方法旨在克服现有技术的以下局限：

  • 灵敏度不足 (Low Sensitivity)：
    • 如PBM和HT-SELEX等主流高通量方法，由于其检测原理（荧光信号强度或富集倍数），对低亲和力的结合事件不敏感。它们的检测阈值较高，导致大量真实的低亲和力位点被当作“噪音”而忽略。
  • 功能相关性不明确 (Lack of Functional Relevance)：
    • PBM测量的是“结合”，MITOMI/BET-seq测量的是“亲和力/能量”，HT-SELEX测量的是“富集”。但这些物理化学上的测量结果是否直接对应于功能性的相互作用（即能驱动下游生物学过程）并不总是清晰的。一个微弱的结合可能没有实际功能意义。

PADIT-seq的原理如下图所示：

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  • 第一阶段的转录产生一个带有ALFA标签的转录因子融合蛋白（DBD就是转录因子的DNA结合结构域），这些融合蛋白将对第二阶段的转录产生影响。
  • 第二阶段的转录由D1pT7启动子调控，这是一个人为修改的T7启动子：
    • 在没有转录因子的条件下，D1pT7会启动低水平转录，产生本底水平的报告基因表达
    • 当融合蛋白（DBD）与候选的DNA片段（TFBS-M）发生结合时，融合蛋白的ALFA标签就会招募T7-RNA聚合酶，启动更高水平的报告基因表达
    • 报告基因的表达水平与DBD-TFBS结合的亲和力成正比——因此可以检测低水平的DNA亲和力片段。

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作者对比了PADIT-seq和另外两种传统方法（uPBM和HT-SELEX）。如Fig1c所示，PADIT-seq在假阳性率的控制上优于uPBM；如Fig1d-e所示，PADIT-seq能够找到比HT-SELEX更多的低亲和力位点。

作者还发现，这些低亲和力位点，并不会决定转录因子是否结合，但是能够影响结合的水平。

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（二）转录因子在基因组中结合重叠的位点

作者使用PADIT-seq，以1bp的步长，对ChIP-seq的peak区域的DNA序列进行滑窗检测。发现在高亲和力位点两侧存在重叠的低亲和力位点。

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另外，如Fig2b所示，相比于背景基因组，ChIP-seq的peak区域，倾向于富集更多的连续亲和位点，这表明连续位点的存在可能对于转录因子的结合是重要的。

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并且这些位点的保守性也更强。

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（三）转录因子对于每个重叠位点的结合是互相独立的

如下图。ChIP-nexus是一种能够以1bp分辨率检测DNA上的转录因子结合区域边界的技术。每个“cut”的位置代表TF与DNA的一个精确的接触边界。

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作者发现，随着重叠的结合位点(overlapping binding site)数量增加：

    1. 检测到的cuts信号的强度在增加（5→10→20）
    1. 有cuts信号的位点数量在增加（a/b → a/b/c → a/b/c/d）
    1. 足迹的整体大小在增加（28bp→29bp→30bp）

也就是说，每个额外的重叠结合位点都会在每条链上多产生一个精确的cut，导致总足迹大小每次增加1bp，因此TF对各个位点是独立结合的。

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（四）同源转录因子的竞争性结合机制

这是本文的重要生物学发现之一。

同源转录因子意味着它们有着相同的识别基序（例如下图中的Cbf1和Pho4，都识别CACGTG框），那么在实际的转录调控中，它们是如何识别各自特异的结合位点呢？

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作者首先通过PADIT-seq鉴定出了311个有亲和力的8-mer结合位点序列。其中，有58个是Cbf1特异的，有219个是Pho4特异的。

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作者使用BET-seq检测了每一种16bp长度的DNA序列组合（其中包括CACGTG这段核心的motif，而侧翼序列则是所有可能的碱基组合）与这两种转录因子的结合亲和力（以相对自由能ΔΔG计）。

  • Fig4b：按照相对亲和力的序列频数统计。存在两个峰，说明侧翼序列对结合特异性有影响。（如果没有影响，那么频数分布应该呈现以0为均值的正态分布）
  • Fig4c：侧翼序列中，Cbf1特异的8-mer越多，则DNA片段对Cbf1的亲和力越强；反之亦然。也就是说，高亲和力位点两侧的低亲和力位点塑造了TF识别的特异性

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作者还使用另外几种方法分别验证了这一点。最终，作者将这一个机制总结为 重叠结合位点模型(overlapping binding sites model) ，即 高亲和力位点两侧的低亲和力位点塑造了TF识别的特异性 。

（五）突变对转录因子结合的影响

检测了SNP对TF-binding的影响。如下图所示，作者发现，SNP影响的位点越多，TF结合的改变越大。

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（六）转录因子结合位点的内在可编织性

所谓“可编织性”（weavable），指的是这些位点之间互相有overlap，可以编织出一张连通图。

如下图，作者提出了一种对TF-binding site进行描述和定量的方法，即网络图——一个节点代表一个k碱基的结合位点（PADIT-seq active k-mers），一条边表示两个节点之间有k-1个bp的序列是重叠的。

作者发现，随机的8-mer序列形成的连通图并不好——最大的单一联通组件只包括7个节点（如下图，左下角）。相比之下，转录因子的连通图，可以形成非常大的单一联通组件（包含80%以上的大部分节点）。

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作者还使用 UniProbe 的数据库中的公共数据进行了验证。发现，对于其他转录因子来说，在这样的网络图中也是能够形成极大的单一联通组件（“这些TF 结合位点始终形成了更广泛的网络”）。

这些结果证明：

  • “可编织性”是真核生物中不同结构家族的 TFBSs 的固有且普遍的特性
  • 重叠结合位点模型很可能代表了真核生物 TF-DNA 相互作用的基本特征。

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结论与讨论

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本文的创新与重要发现：

  • 提出了一个检测TF-DNA相互作用的测序技术，即PADIT-seq，能够以高灵敏度检测TF的低亲和力位点
  • 发现TF的高亲和力位点侧翼会有许多低亲和力位点，这些低亲和力位点对于TF的结合起到重要调控作用 → 重叠结合位点模型
  • 回答了两个生物学问题：
    • ①旁系同源TF的竞争特异性
    • ②非编码变异（SNPs）的功能效应
  • 通过连通图发现TF-binding site的序列特征表现出一种“可编织性”

局限性：

  • PADIT-seq是一种体外测序技术，无法完全模拟体内环境
  • PADIT-seq的检测灵敏度，受到多种因素的影响：反应底物浓度（转录因子、T7聚合酶等），测序深度，统计检验阈值。因此PADIT-seq可能仍然无法捕获所有的低亲和力相互作用。
  • 文章研究对象是真核生物；对于原核生物，其转录因子是否也有“可编织性”？这种特性的进化起源又是什么？这些问题值得研究