基于crux的蛋白质谱定量

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在近期工作当作，我需要处理一个蛋白质组学的数据集，于是在数据处理和查询资料的过程中，学习了相关的知识，以及crux的用法。

1、背景

1.1 蛋白质组学的测序原理和数据来源

蛋白质组学研究的测序主要采取质谱方法。质谱方法的测序原理略（下面是一个AI总结）。

质谱法的基本原理是将样品分子电离，并按照其质荷比（m/z）进行分离和检测。蛋白质组学中，蛋白质首先被酶切（如胰蛋白酶）分解成小肽 段，然后通过液相色谱（LC）将这些肽段分开，再通过质谱仪进行分析 。

质谱仪主要有两种类型：串联质谱（MS/MS）和飞行时间质谱（TOF）。 在串联质谱中，首先使用一级质谱（MS1）对肽段进行初步的质量分析，然后选择特定质量的肽段进行碰撞诱导解离（CID），产生二级碎片离子，最后通过二级质谱（MS2）对这些碎片离子进行质量分析。通过对这些碎片离子的质量进行比较，可以推断出原始肽段的序列信息。而在飞行 时间质谱中，样品分子在电场作用下加速，根据它们的质荷比不同，以 不同的速度穿过真空管道，从而实现分离和检测。

通过比较实验获得的质谱数据与理论数据库中的肽段信息，可以确定蛋 白质的身份和修饰状态，进而揭示整个蛋白质组的组成和变化。

事情是这样的，在近期工作当作，我需要处理一个蛋白质组学的数据集。这个数据集包含了若干raw文件（质谱平台的原始下机数据）、若干mgf文件（质谱峰列表文件）和一个mzid文件（质谱鉴定结果）。我需要将它们整理为表达矩阵的格式。但是mgf文件和mzid文件都不是我熟悉的文件类型，于是进行了一番探索（特别是后者）。

1.2 MZID格式介绍

参考：

质谱数据文件解析（一）—mzML格式 - 馒头的文章 - 知乎

这是Institute for Systems Biology (ISB) 提出的一种质谱数据存储格式，旨在统一之前充斥于市面上的mzData和mzXML两种不同的数据格式。其本质上是一个XML文件，通过各种标签存储谱图信息。

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2、MZID的处理工具

2.1 PEAKS Studio

参考：

但是这个工具是商业软件，且测试版国内下载很不方便（网站上说 “It appears that you are from Mainland China. Baizhen Biotechnologies is our distributor in this region. Please send email to sales-china@bioinfor.com or phone +86-21-60919891 to request your demo.”。给提到的国内代理商发邮件，并没有得到回信）。遂放弃探索。

2.2 crux

后来，检索到了一篇论文：

Jones, Andrew R et al. “The mzIdentML data standard for mass spectrometry-based proteomics results.” Molecular & cellular proteomics : MCP vol. 11,7 (2012): M111.014381.

image.png

这篇论文中提到了crux这个开源工具，可以读取mzid格式的蛋白质谱，并进行定量分析。这是我们需要的。

3、基于crux的蛋白质谱定量

3.1 安装

在crux官网下载页面上下载对应的系统版本的包即可。

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下面我们以Linux为例说一说使用方法。

假设我们下载的文件名称是 crux-4.2.Linux.x86_64.zip ，现在我们用下面的指令进行解压，然后进入软件目录，就可以看到文件结构

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unzip crux-4.2.Linux.x86_64.zip  -d crux
cd crux/crux-4.2.Linux.x86_64/
ls

整个目录的结构如下：

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├── bin
└── doc
    ├── comet-options
    ├── commands
    ├── example-files
    ├── file-formats
    ├── images
    └── tutorials

其中，在 bin 目录下有一个单一的可执行文件 crux ，这个就是主程序。

image.png

我们也可以把crux所在的目录加入系统环境变量，以便于后面我们用 crux 指令进行访问。

3.2 crux的使用方法（转码和定量）

参考crux官方文档：

crux主命令
crux-谱定量
crux-PSM文件转码

PSM文件代表肽段-谱图匹配（Peptide-Spectrum Match）文件，通常包含每个质谱谱图对应的肽段信息、得分、q值等。PSM文件可以是不同的格式，包括mzid格式、SQLite格式、tsv格式、pepXML等

我们的谱文件是mzid格式的。问了一下DeepSeek，其建议我先转换为tsv格式，以进行下一步的处理。

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# 我们的输入文件名是peptides_1_1_0.mzid.gz
crux psm-convert --input-format mzidentml 
	--overwrite T peptides_1_1_0.mzid.gz tsv 2>/dev/null

上述步骤将会在当前目录创建文件夹 crux-output ，然后在这个文件夹中生成三个文件：

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psm-convert.log.txt
psm-convert.params.txt
psm-convert.txt

其中的 psm-convert.txt 是转码结果。

随后的定量过程需要 crux spectral-counts 指令。定量过程还需要准备fasta格式的数据库文件，见下一步。

3.3 在uniprot上下载对应的fasta文件的方法

假设我们测序的物种是人（HUMAN）。我们按照下图中的步骤，完成这一文件的下载。

1739869868600.png

1739869924809.png

1739869985484.png

1739870053487.png

3.4 定量

假设上一步下载好的文件为 uniprotkb_HUMAN.fasta.gz 。我们将其和待处理的psm文件放在一起（见本文4.2小节。文件路径为 crux-output/psm-convert.txt ），然后先解压，再运行crux：

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# 解压缩。crux似乎不支持读取经过压缩的fasta文件
gnzip uniprotkb_HUMAN.fasta.gz
# 使用crux进行谱定量
crux spectral-counts \
	--threshold-type none \
	--overwrite T \
	crux-output/psm-convert.txt \
	--protein-database uniprotkb_HUMAN.fasta

这将会在 crux-output 目录下生成三个文件：

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spectral-counts.log.txt
spectral-counts.params.txt
spectral-counts.target.txt

其中的 spectral-counts.target.txt 就是我们所需的质谱定量文件。